Исследование флуоресценции эндогенного флавина биолюминесцентной системы люцифераза-НАДН:ФМН-оксидоредуктаза

Благодаря высокой чувствительности к поллютантам биолюминесцентные системы нашли широкое применение в качестве биотестов в экологическом мониторинге природных водоемов и медицинских исследованиях. Отклик биолюминесцентных систем на влияние поллютантов является интегральным и обусловлено сложным действием экзогенных соединений на биолюминесценцию. Основной принцип биолюминесцентного анализа -корреляция между токсичностью среды и ее влиянием на интенсивность биолюминесценции. При этом экзогенные вещества либо ингибируют, либо активируют биолюминесценцию. Эффективность действия веществ на биолюминесценцию определяется как структурой вводимых соединений, так и строением и механизмом функционирования биолюминесцентных систем.

Присутствие экзогенных соединений в биолюминесцентной системе приводит к изменению скорости некоторых процессов, в результате чего равновесие системы смещается. Это смещение равновесия выражается в изменении интенсивности биолюминесценции. Изучение действия различных химических веществ на люминесценцию бактерий позволяет судить об их биологическом действии.

На сегодняшний день изучение механизмов действия на биолюминесценцию различных классов химических соединений является актуальным, поскольку позволяет прогнозировать чувствительность биолюминесцентных тестовых систем, к поллютантам.

Один из механизмов влияния экзогенных соединений на биолюминесценцию - взаимодействие их с ферментами. Для изучения динамики ферментов в различных молекулярных окружениях в настоящее время используют высокочувствительные методы флуоресцентной спектроскопии.

Различные виды люминесценции

Люминесценция — один из широко распространенных в природе видов излучений. Она возникает в результате поглощения веществом энергии возбуждения и перехода его частиц из нормального в возбужденное электронное состояние. Люминесценцией называют избыточное над тепловым излучением тела при данной температуре, имеющее длительность, значительно превышающую период излучаемых световых волн. Такой переход может осуществляться безизлучательно путем передачи энергии возбуждения окружающей среде в виде тепла или с излучением, которое и будет называться люминесценцией. Люминесценцией называют избыточное над тепловым излучением тела при данной температуре, имеющее длительность, значительно превышающую период излучаемых световых волн.

Признак длительности в этом определении был предложен С. И. Вавиловым для того, чтобы отличить люминесценцию от некоторых других явлений вторичного свечения, например отражения и рассеяния света.

В зависимости от вида возбуждения различают несколько типов люминесценции.

Люминесценция, вызванная заряженными частицами: ионами — ионолюминесценция, электронами — катодолюминесценция, ядерным излучением - радиолюминесценция. Люминесценцию под воздействием рентгеновского и V-излучения называют ренгенолюминесценцией, фотонов -фотолюминесценцией. При растирании, раздавливании или раскалывании некоторых кристаллов возникает триболюминисценция. Электрическим полем возбуждается электролюминисценция, частным случаем которой является свечение газового разряда. Люминесценцию, сопровождающую экзотермическую химическую реакцию, называют хемилюминесценцией.

Фотолюминесценция

Фотолюминесценция, называемая иногда просто люминесценцией, подразделяется на флуоресценцию (кратковременное послесвечение) и фосфоресценцию (сравнительно длительное послесвечение).

Начальным актом любой фотолюминесценции является возбуждение фотоном с энергией hv атома или молекулы.

Ряд биологически функциональных молекул, например молекулы белков, обладает флуоресценцией. Параметры флуоресценции чувствительны к структуре окружения флуоресценцирующей молекулы, поэтому по люминесценции можно изучать химические превращения и межмолекулярное взаимодействие.

Хемилюминесценция

Люминесценция, сопровождающая химические реакции, называется хемилюминесценцией.

Она испускается либо непосредственно продуктами реакции, либо другими компонентами, которые возбуждаются в результате переноса энергии им от продуктов реакции.

Яркость хемилюминесценции, т. е. число квантов, испускаемых в единицу времени, возрастает с увеличением скорости реакции и эффективности хемилюминесценции - среднего числа квантов, приходящегося на один акт реакции. По хемилюминесценции можно определить состав вещества (хемилюминесцентный анализ).

Частное проявление хемилюминесценции - свечение, сопровождающее химические реакции биологических объектов, - называют биохемилюминесценцией. Излучение гнилушек, светляков - примеры биохемилюминесценции (биолюминесценции).

Светящиеся бактерии

Светящиеся бактерии - грамотрицательные подвижные палочки размером в среднем около 0,5 х 2,5 мкм. Классификация их на сегодняшний день не установилась и постоянно пересматривается. Известно три рода морских светящихся бактерий: Photobacterium, Beneckea (Vibrio), Alteromonos. К пресноводным видам относятся Vibrio cholerae и симбиотический вид Xenorharbdus luminescens, выделенный из почвенных нематод.

Экологическая ниша светящихся бактерий изучена мало. Можно лишь утверждать, что, в отличие от существующего взгляда о крайней редкости этих бактерий, они представляют собой весьма обычную группу морской микрофлоры. Они живут в водах морей от тропиков до высоких широт, редко встречаются в поверхностном слое, в основном их ареал приурочен к зонам повышенной концентрации планктона. Сейчас суверенностью можно сказать, что светящиеся бактерии распространены по всему Мировому океану. Также были описаны случаи свечения льда в Северном Ледовитом океане.

Светящиеся бактерии включают свободнодвижущие, сапрофитные и паразитирующие формы. В океане они располагаются преимущественно на глубинах от 100 до 300 т от 500 до 700 метров.

Светящиеся бактерии — облигатные аэробы по свечению и факультативные анаэробы в отношении роста. Кислород используется бактериями при аэробном росте и является необходимым компонентом реакции биолюминесценции.

Мы можем сказать, что рыбам нужно свечение бактерий. Ведь свет - это средство связи, это сигнал «я здесь», который в миллион раз повышает вероятность встречи самца и самки, особенно на глубине, где темно и мало рыб. Свечение служит маскировкой. Например, на фоне дневного света светящуюся рыбу или кальмара хищник не заметит.

Светящиеся бактерии используются в измерительных системах биотестировании токсичности. Создана коллекция различных видов морских светящихся бактерий. В коллекции ведутся работы по идентификации, изучению физиологии, биохимии и цитологии. Также эти микроорганизмы могут расти на простых средах с глюкозой и другими органическими субстратами. Однако хороший рост и люминесценции светящихся бактерий наблюдается только на богатых средах. Бактерии подвижны только благодаря одному или пучку неочехленных жгутиков. Хемоорганотрофы. Факультативные аэробы. Оптимальная температура 20-30 градусов. На среде без хлорида натрия роста нет. Растут при концентрациях хлорида натрия от 0,5 до 5% и рН 6 - 9. Оптимальной является концентрация хлорида натрия 3%. Спектр свечения лежит в области 420 нм с максимумом 472 нм.

Светящие бактерии - это самые маленькие живые источники света. Квантовый выход биолюминесценции составляет 0,1 - 0,5, а светоизлучение наблюдается в сине-зеленой части видимого спектра с максимумом 478-505 нм. Бактерии выделяют в среду вещество, которое возбуждает свечение. Когда их мало, этот стимулятор рассеивается в воде, а когда бактерий собирается достаточное количество, он проникает обратно в клетку и индуцирует работу генов, ответственных за выработку фермента люциферазы, которая необходима для биолюминесценции.

Биолюминесцентная биферментная система

В настоящее время полиферментные системы с бактериальной люциферазой интенсивно исследуются и широко используются в биолюминесцентном анализе. Исследование систем с бактериальной люциферазой, включающих ряд сопряженных окислительно-восстановительных реакций, представляет обширную область для моделирования механизмов сопряжения между ферментами и конструирования искусственных систем для аналитических целей.

Для расширения круга анализируемых веществ, увеличения чувствительности биолюминесцентных систем, используют искусственные полиферментные системы с последовательной передачей восстановительных эквивалентов исходных субстратов до бактериальной люциферазы. Любой фермент, катализирующий синтез in vitro субстрата люциферазы, образует с люциферазой сопряженную ферментативную систему реакций. К ним относятся ферменты, катализирующие реакции образования альдегида (алкогольдегидрогеназа и редуктаза жирной кислоты), ФМН (рибофлавинкиназа), ФМНН2 (НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктаза).

Наиболее широко исследована и описана биолюминесцентная биферментная система НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза, осуществляющая следующую цепь ферментативных реакций:

В настоящее время биолюминесцентная биферментная система, как и светящиеся бактерии, успешно используются в экологическом мониторинге природных водоемов благодаря высокой чувствительности к ксено. биотикам и высокой скорости анализа (5-10 минут).

Взаимодействие люциферазы с субстратами реакции

Люцифераза формально относится к классу монооксигеназ. Очищенные люциферазы из разных бактериальных видов схожи по структуре ((( гетеродимеры), молекулярной массе (~79 кДа), и аминокислотной последовательности. Хотя существует разница в скорости катализа для различных люцифераз, все они функционируют по одинаковому механизму.

Не смотря на то, что исследованы кристаллические структуры бактериальных люцифераз и идентифицированы их аминокислотные последовательностири, до сих пор не установлена точная локализация на ферменте сайтов связывания ФМНН2 и альдегида.

Природная структура люциферазы ((( -димер) имеет высокую активность в люминесценции. Отдельные субъединицы, ( мономер и (2 димер, также проявляют люминесцентную активность, хотя их активность в реакции на четыре порядка меньше, чем активность гетеродимера. Установлено, что люциферазы, как (( -димер, так ( и (2 формы имеют сайт связывания ФМНН2, который перекрывается с сайтом связывания альдегида.

Бактериальные люциферазы весьма специфичны по отношению к ФМНН2, и как показано в ряде работ, производные флавина (за исключением флавинов, замещенных в редокс активных позициях N1-C10a-C4a-N5), являются субстратами для люциферазной реакции.

Флавины (замещенные изоаллоксазины) участвуют в реакциях переноса протонов и электронов в биологических системах. Они играют важную роль не только в биолюминесценции, но и в других метаболических процессах, которые формируют циклы окислительно-восстановительных преобразований, например, дыхание. Свойствам флавинов и их роли в биологических процессах посвящено огромное количество работ.

Редокс-активная часть флавина - это изоаллоксазиновое кольцо, которое может существовать в различных редокс-состояниях: окисленной, восстановленной формах, а также в форме семихинона. В биологических системах флавины встречаются как в свободном состоянии, так в качестве простетической группы ферментов. Флавиновая простетическая группа связана со своим белком посредством суперпозиции сил, происходящих из водородного связывания, гидрофобных и электростатических взаимодействий. При этом редокс потенциал флавина зависит от природы активного сайта фермента, в котором находится и меняется в широком ряду белков. Изменение окружения фермента или воздействие физических факторов (температуры, давления и др. ) влияют на эффективность такого взаимодействия, что непосредственно отражается на его каталитической активности.

Изоаллоксазиновая часть флавина является амфифильной, состоящей из гидрофобной части и гидрофильной пиримидиновой части, а также кольца, в котором локализованы редокс-активные атомы, непосредственно участвующие в окислительно-восстановительных реакциях.

При взаимодействии с белками гидрофобная часть флавина либо контактирует со средой, либо связывается путем гидрофобных взаимодействий с протеином. Кольцо зачастую не вовлечено в окислительно-восстановительный процесс флавиновой части и играет непрямую роль в качестве поляризованного источника для изменений, происходящих в редокс активных N l-C10a-C4a-N5.

Из опытов по определению константы диссоциации и люминесцентной активности различных флавинов с бактериальной люциферазой следует, что для связывания и проявления люминесцентной активности большое значение имеет как структура изоалоксазинового кольца, так и отрицательно заряженная боковая цепь флавинов. Для ряда бактериальных люцифераз (Vibrio fischeri, Vibrio harveyi, Photobacterium Phosphoreum) установлены отношения между скоростью спада интенсивности биолюминесценции и окислительным потенциалом связанного с ферментом 4а-гидроксифлавина.

Люциферазы из разных видов светящихся бактерий имеют сходное сродство к ФМНН2 , что выражается в близости значений кинетических констант Михаэлиса и констант диссоциации фермент-субстратного комплекса. Связь люциферазы с продуктом реакции - ФМН, на три-четыре порядка меньше, чем с ФМНН2. И как показано в ряде работ, при связывании с люциферазой ФМНН2 не доступен для внешнего воздействия.

Окислительно-восстановительная реакция, катализируемая НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазой

В биолюминесцентных системах in vitro эффективным источником ФМНН2 для хемилюминесцентной реакции служит окислительно-восстановительная реакция, катализируемая НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазой (R).

НАДН + ФМН + R ( НАД+ + ФМНН- + R

Физиологические функции НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктаз до сих пор четко не определены. Есть предположение, что они не имеют специфических функций, а скорее служат как общий цитозольный источник электронов. Восстановленный флавин является существенным для различных биологических процессов, таких как метаболизм железа, метаболизм кислорода, репликация ДНК, биолюминесценция и др..

Много интересного связано с ролью флавин-редуктаз в бактериальной биолюминесценции. Флавин-редуктазы определены во всех светящихся бактериях, и как считается, обеспечивают люциферазу восстановленным флавином в качестве субстрата для люминесцентной реакции. Участие НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктаз в люминесцентных процессах in vivo до сих пор вызывает большие сомнения, так как для этого фермента не выполняется главный принцип, определяющий принадлежность белка к люминесцентной системе: его содержание в бактериях не зависит от содержания люциферазы и интенсивности люминесценции.

Флавин-редуктазы могут быть так же разделены на два класса на основе содержания простетической группы. Так например, НАДН:ФМН-оксидоредуктазы из Vibro harveyi, Beneckea harveyi не содержат простетическую группу, в то время как НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазы в Vibro harveyi и Vibro fischeryi имеют нековалентно связанный флавиновый кофактор.

Флавин-редуктазы в светящихся бактериях также различаются сродством к ФМН, ФМНН2, кинетическим механизмам, и предполагаемыми взаимодействиями с люциферазой.

Анализ кристаллической структуры данной НАДФН:ФМН-оксидоредуктазы Vibro fischeri. показал, что флавиновый кофактор связан с ферментом 16-ю водородными связями. Практически каждый атом N или О окисленного ФМН способен образовывать водородные связи с ферментом. Сайт связывания ФМН представляет собой узкую щель, которая не может устроить тройной комплекс флавинового кофактора, НАДФН и субстрата ФМН, поэтому НАД+ высвобождается до того, как субстрат ФМН может связаться с ферментом.

Известно, что НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазы имеет меньшее сродство к своему флавиновому кофактору после его восстановления. При восстановлении флавина ослабевают или разрываются водородные связи, предположительно, N5-атома флавина с аминокислотными остатками, поэтому сродство восстановленного кофактора к апоферменту меньше, чем окисленного ФМН. Тем не менее, оставшиеся водородные связи способны стабилизировать восстановленный флавиновый кофактор. Если восстановленный кофактор остается связанным с ферментом, он не может участвовать как субстрат в последовательном механизме, а участвует в «пинг-понг» механизме, описанном выше.

В ряде работ продемонстрировано, путем использования ряда синтетических аналогов флавинов, действующих как субстраты или как ингибиторы реакции, что флавин-редуктазы распознают флавин исключительно через изоалоксановое кольцо. Рибитилфосфатная часть ФМН не значительно вовлечена во взаимодействие с ферментом. Это, вероятно, объясняет тот факт, что по сравнению с другими флавопротеинами флавин-редуктазы связывают флавины менее специфично и менее жестко. Изучение таких взаимодействий должны обеспечить новое понимание взаимодействия флавина с ферментами. Так как ФМН является флуоресцентной молекулой, то флуоресценцию флавинового кофактора можно использовать для изучения поведения редуктаз в различных условиях.

Методы спектроскопии для исследования биологических молекул

Для изучения строения и динами биологических молекул широко используются методы абсорбционной и флуоресцентной спектроскопии.

Спектры являются источником различной информации.

Прежде всего, по виду спектра поглощения и испускания можно идентифицировать атомы и молекулы, что входит в задачи качественного спектрального анализа. По интенсивности спектральных линий определяют количество излучающих (поглощающих) атомов - количественный спектральный анализ.

По спектрам можно судить о строении атома или молекулы, структуре их энергетических уровней, подвижности отдельных частей больших молекул и т. п.

Молекулярные спектры.

Молекулярные спектры (испускания и поглощения) возникают при квантовых переходах молекул с одного энергетического уровня на другой и состоят из совокупности тесно расположенных линий.

Сложность молекулярных спектров по сравнению с атомными обусловлено большим разнообразием движений и, следовательно, энергетических переходов в молекуле.

Специфичность и индивидуальность спектров молекул лежит в основе качественного и количественного спектрального анализа. Молекулярные спектры позволяют исследовать не только строение молекул, но и характер межмолекулярного взаимодействия.

Спектры поглощения - это важный источник информации о молекулах. Во многих случаях эти спектры регистрируют как сплошные. Например, кожа человека поглощает излучение в самых верхних слоях, т. к. ультрафиолетовой части показатель поглощения велик. В видимой области показатели поглощения снижается и остается почти постоянным до красной области.

Поляризация люминесценции

Одной из важных и информативных характеристик люминесценции является ее поляризация или анизотропия флуоресценции.

Излучение отдельной молекулы всегда анизотропно-поляризованно. Очевидно, что поляризованным будет также излучение совокупности молекул при наличии их определенной ориентации в среде (естественная анизотропия).

Несмотря на хаотическое распределение молекул люминесцирующего вещества в среде, анизотропия излучения возникает вследствие того, что колебания электрического вектора возбуждающего света происходит в плоскости, перпендикулярной направлению его распространения, и преимущественно возбуждаются те молекулы, осцилляторы поглощения которых расположены в этой плоскости. Величина

Формула 1

Где F и F( - интенсивности соответственно параллельной и перпендикулярной составляющей поляризованного излучения относительно выбранного направления (вертикально), называется степенью поляризации.

Необходимым условием наблюдения поляризованной люминесценции является сохранение первоначально возникшей анизотропии за время жизни возбужденного состояния молекул. В результате броуновского вращательного движения возбужденные молекулы могут повернуться на значительный угол, и к моменту испускания света приобретенная анизотропия раствора будет утрачена. Деполяризация люминесценции может наступить также вследствие межмолекулярной миграции энергии либо простого перепоглощения излученного света и появления вторичной люминесценции. Следовательно, для разбавленных растворов величина степени поляризации будет определяться, с одной стороны, временем жизни возбужденного состояния т исследуемых молекул, а с другой - параметрами, характеризующими время их вращательной релаксации в растворе. Время вращательной корреляции определяется массой и геометрическими размерами излучающей молекулы.

Вероятность поглощения кванта света молекулой зависит от угла между направлениями электрического вектора падающего света и вектора электронного перехода при поглощении света. Поэтому если освещать образец светом, поляризованным вдоль оси Oz, то поглощать его будут преимущественно те молекулы зонда, переходные. моменты которых параллельны z. Допустим, что молекулы зонда неподвижны и угол β= 0. В этом случае флуоренсценция будет также поляризована преимущественно вдоль оси Oz. Если измерять флуоресценцию, излучаемую в направлении оси Oу, пропустив ее через поляризатор, то компонента, поляризованная параллельно поляризации возбуждающего света (F), будет больше, чем F(. В связи с этим степень поляризации флуоресценции (Р) можно характеризовать разницей (F - F(), нормированной на сумму (F + F():

Формула 2

Полный свет флуоресценции пропорционален F + 2 F(. Поэтому физически более оправданной характеристикой поляризованной флуоресценции может служить другой параметр - анизотропия (г).

Формула 3

Величины Риг однозначно связаны друг с другом:

Формула 4

Общая характеристика люминесценции белков

Люминесценция белков может быть обусловлена аминокислотами, входящими в состав полипептидной цепи макромолекул (назовем эту люминесценцию собственной), простетическими группами (восстановленные пиридиннуклеотиды и флавины), связанными с белковой частью сложных ферментов, и, наконец, химически присоединенной меткой - красителем.

Для анализа ферментов широко используется люминесценция, входящих в его состав аминокислот, таких как триптофан, фенилаланин, тирозин. Однако существут трудности и неудобства использования собственной люминесценции. Например, спектры флуоресценции триптофана в нативных белках довольно сильно различаются, принимая значения λmax от 327 (карбоксипептидаза) до 343 нм. Обычно белок имеет в своем составе несколько триптофановых остатков, а разделить и анализировать люминесценцию одновременно от нескольких источников может быть связано с усложнением процедуры исследования.

Поэтому в данной работе предложено исследовать возможность использования флуоресцентных характеристик молекул ФМН, которые связаны с ферментами (люциферазой и НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазой) в качестве кофакторов. Анализ литературных данных позволил установить, что флавиновые кофакторы люциферазы и НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазы локализованы в активных центрах ферментов, что является также преимуществом над использованием флуоресценции триптофановой флуоресценции.

Материалы и методы исследования

Реактивы и материалы

В работе использованы следующие реактивы: ФМН ("Serva", Германия). Лиофилизованный препарат люциферазы Photobacterium leiognathi (0,5 мг) и лиофилизованный препарат НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазы из Vibrio fischeri (0,15 ед. активности), произведенные в секторе биотехнологии Института биофизики СО РАН (Красноярск).

При выполнении исследований использовали свежеприготовленные растворы.

Образцы исследованных соединений растворяли в 0,02 М калий-фосфатном буфере (рН 6,8).

Методы измерений

Измерения флуоресценции и анизотропии флуоресценции при постоянном возбуждении

Запись спектров возбуждения и испускания (фотолюминесценции), а также измерения поляризации и анизотропии флуоресценции выполнены на флуориметре "Amineo-Bowmau Series 2" (рабочий диапазон 180-1000 нм).

Измерения флуоресценции и анизотропии флуоресценции при постоянном возбуждении проводили в препаратах ферментов, люциферазы и НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазы.

Исследуемый образец облучали, используя монохроматический источник света (длина волны возбуждения 450 нм, ширина щели 0,1 мм), в течение 1 мин. Измерения интенсивности флуоресценции образца сделаны при одноканальном счете фотонов.

Анизотропия флуоресценции определялась из отношения сигналов, поступающих из анализаторов, один из которых фиксировал интенсивность вертикально поляризованного света (I(, другой фиксировал интенсивность горизонтально - поляризованного света (I). Ориентация анализаторов была калибрована.

Поляризацию флуоресценции при постоянном возбуждении рассчитывали по формуле:

Формула 5

Анизотропии флуоресценции при постоянном возбуждении рассчитывали по формуле

Формула 6 где , I( - интенсивность вертикально поляризованного света, I - интенсивность горизонтально – поляризованного света.

Статистическая обработка результатов и построение графиков проводилась с использованием пакета прикладных программ ЕXCEL («Microsoft», США).

Результаты и обсуждение

Флуоресцентные характеристики препаратов ферментов

Исследование триптофановых остатков люциферазы и НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазы

В результате работы исследованы спектры испускания триптофановых остатков в препаратах люциферазы и НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазы.

Полученные спектры флуоресценции в соответствии с литературными данными характерны для флуоресценции триптофанов. Как видно из рисунка, при возбуждении растворов люциферазы и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы (240 нм) наблюдаются спектры испускания с максимумом в области 340 нм, характерным для флуоресценции триптофанов.

Спектры возбуждения и испускания эндогенного флавина в препарате люциферазы и НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазы

При изучении флуоресцентных характеристик препаратов ферментов помимо флуоресценции в ультрафиолетовой области спектра, характерной практически для всех белков и обусловленной флуоресценцией триптофановых остатков, обнаружена флуоресценция в видимой области спектра.

Представлены спектры испускания (λвозб=450 нм) растворов люциферазы и ФМН.

Представлены спектры испускания ФМН ((возб=450 нм) в препаратах люциферазы и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы

Спектры испускания ФМН и раствора

НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазы практически совпадают. Спектры испускания ФМН и препарата люциферазы близки, как и в случае НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазы. Разница в коротковолновой части спектров может быть связана с реабсорбцией люминесценции ФМН в области перекрывания спектров флуоресценции и поглощения.

Таким обратом, наблюдаемый спектр люминесценции препарата люциферазы и НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазы при возбуждении 450 нм характерен для эндогенного флавина.

Как уже отмечалось, НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктаза, выделенная из Vibrio fischeri имеет в своем составе нежестко связанный флавин в виде кофактора. Как известно, спектральные характеристики изоаллоксазинового фрагмента кофактора сильно различаются для различных флавин- содержащих ферментов. Люциферазы светящихся бактерий также имеют сродство к продукту реакции – ФМН, который практически всегда присутствует в препаратах очищенных ферментов.

Исследование поляризации и анизотропии флуоресценции эндогенных флуорофоров в препарате люциферазы и НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазы

Исследования поляризация и анизотропия флуоресценции выполнены при постоянном возбуждении.

В результате анализа интенсивности поляризованного света рассчитаны значения поляризации и анизотропии флуоресценции для триптофановых остатков в препаратах ферментов. Результаты расчетов представлены в таблице 1.

Значения поляризации и анизотропии флуоресценции триптофанов и эндогенного флавина в препаратах люциферазы и НА Д (Ф)Н: ФМН-оксидоредуктазы.

Флуоресценция триптофана Флуоресценция флавина

Поляризация Анизотропия r тр. Поляризация Анизотропия

Р тр. Р фмн r фмн

ФМН - - 0,0059 ( 0,0006 0,0039 ( 0,0007

Люцифераза 0,011 ( 0,003 0,03 ( 0,005 0,029 ( 0,004 0,026 ( 0,003

Редуктаза 0,0099 ( 0,001 0,011 ( 0,005 0,022 ( 0,007 0,015 ( 0,002

Как видно из таблицы значение поляризации флуоресценции и анизотропии флуоресценции в случае люциферазы выше, чем соответствующие значения для НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазы. Различия обусловлены разной молекулярной массой ферментов. В соответствии с литературными данными молекулярная масса люциферазы 81 кДа, НА Д(Ф)Н: ФМН-оксидоредуктазы 27 кДа.

Значения поляризации и анизотропии флуоресценции эндогенного флавина в препаратах ферментов значительно выше, чем соответствующие значения для молекулярного (свободного) ФМН. Полученные результаты указывают на то, что эндогенный флавин в препаратах ферментов, флуоресценцию которого наблюдали, связан с ферментами, люциферазой и НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазой. На это указывают и значения поляризации и анизотропии флуоресценции эндогенного флавина, которые сопоставимы с соответствующими значениями поляризации и анизотропии флуоресценции триптофанов. Как и в случае триптофановой флуоресценции, значения поляризации и анизотропии флуоресценции эндогенного флавина выше в случае люциферазы, чем НАД(А)Н:ФМН-оксидоредуктазы.

Таким образом, в результате сравнения спектров испускания ((возб=450 нм) препаратов очищенных ферментов люциферазы и НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазы и соответствующих спектров ФМН показана их идентичность. На основании полученных данных сделан вывод, что при указанных условиях возбуждения растворов ферментов можно наблюдать флуоресценцию эндогенного флавина. Значения анизотропии флуоресценции эндогенного флавина указывают на взаимодействие флавина с люциферазой и НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазой. Следовательно, можно рекомендовать использовать эндогенный флавин в качестве флуоресцентной метки для исследования взаимодействия экзогенных соединений с ферментами биолюминесцентной системы (люциферазой и НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазой).

Итого:

В результате сравнения спектров поляризации и флуоресценции эндогенного флавина в препаратах ферментов люциферазы и оксидоредуктазы, и соответственно спектров ФМН показана их идентичность. Установлены характеристики флуоресценции (поляризации и анизотропии) триптофановых остатков эндогенного флавина в препаратах ферментов

В результате их сравнения, показано, что значение анизотропии флуоресценции для триптофана, ФМН имеют схожее значение, в случае люциферазы (0,03), в случае редуктазы (0,015), что указывает на то, что флавин жестко связан с ферментами, поэтому флуоресцентные характеристики эндогенного флавина можно использовать для анализа динамики этих ферментов. Так же схожи и характеристики поляризации флуоресценции для триптофана, ФМН, в случае люциферазы (0,02), в случае редуктазы (0,016), что подтверждает возможность использования эндогенного флавина для анализа динамики ферментов биолюминисцентной системы люцифиразы и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы.